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例年ですとASMS本会議場内で2日間に渡って朝食ミーティングを開催するところですが、さすがに今年は叶いませんので YouTube を利用したバーチャルプレゼンテーションをご案内いたします。

「今月の小技」では、タンパク質定量比に対するp値の計算方法についてご説明いたします。

Mascotニューズレターの バックナンバーはこのページ からご覧いただけます。日本語版は「Japanese」リンクをクリックしてください。また、Mascotニューズレターの内容に関してお気づきの点やご質問などありましたらご連絡ください。

 

今月のトピックス

ASMS Reboot バーチャルプレゼンテーション
タンパク質定量比に対するp値の計算方法
 

ASMS Reboot
バーチャルプレゼンテーション

Mascot 2.7の新機能

Mascot 2.7ではクロスリンクペプチド検索機能、プロテインFDR計算機能、多価プロダクトイオンデータへの対応、修飾に対する検索方法の変更、複数の検索結果のマージ機能など、新しい機能を盛沢山にサポートしました。使い方も含めて具体的にご説明します。

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クロスリンクペプチドの同定

検索条件設定画面の [Crosslinking] 選択リストから、予め作成したクロスリンクメソッド(使用するリンカー、リンカー結合サイト、リンカーの方向性、クロスリンク生成物などの適用情報を定義したもの)を指定することによりクロスリンクペプチドを含めた検索モードになります。また、リンカーは Unimod と同じ書式で [Linkers] エディタを利用して登録します。シロイヌナズナのデータを使って具体的操作方法、検索結果の見方をご説明します。

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修飾に対する検索方法の改善

互いに独立な3つの修飾検索条件を設定できるようにし、検索すべき修飾サイトを一様乱数方式で選び出すようにしました。この3つの条件を調整することにより、修飾の数が少ない場合は検索時間を短縮することができ、修飾の数や修飾サイトが多い場合はより多くの修飾ペプチドを検出すると同時に、より精度の高い修飾解析ができるようになります。マウス由来と H4由来のデータを使ってご説明します。

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定量計算結果のCSV出力

Mascot Daemon 2.7 を使ってMascot ServerあるいはMascot Distillerの定量計算を実行した場合は、Mascot Daemon 2.7 側で定量計算結果(Quantitation Summaryと呼んでいます)をCSVファイルにまとめる機能を実装しました。Rパッケージ( Bioconductor など)や Perseus などのアプリケーションを利用して様々な解析を実施することができます。ラベルフリー、8plex iTRAQ、10plex TMTの定量データを使ってご説明します。

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Tissue transglutaminase

タンパク質定量比に対するp値の計算方法

タンパク質の定量比は、Mascot検索でマッチした(そのタンパク質に帰属する)ペプチドの定量比を平均して求めますが、ペプチドの定量比は正規分布に従わないため、それらを対数変換して(対数空間上で正規分布に従うと仮定して)統計処理しています。

タンパク質の定量比が有意に変動しているかどうかはt検定を使って判定しています。帰無仮説は「母集団の平均値は1(そのタンパク質に帰属するペプチドの定量比の平均値は1)」としていますので、信頼係数95%で求めた信頼区間が1から外れる場合はタンパク質の定量比の値などを太文字で強調表示するようにしています。たとえば、ペプチド定量比の数がn=25、これらの幾何平均がm=0.896、同様に幾何標準偏差がs=1.15、自由度n-1に対するt分布の95%に対応する信頼係数をt分布表で調べるとc=2.064ですので、この場合の信頼区間は「 0.896/1.15^(2.064/√25)=0.846 から 0.896*1.15^(2.064/√25)=0.949 まで」となり、1から外れていますので太文字で表示しています。

タンパク質定量比の期待値pはタンパク質定量比のt値から計算することができます(t検定の式に対数をとって変形すると t=log(m)/(log(s)/√n) になります)。上の例を適用するとt=-3.929になりますので、アナログ的な操作では、t分布表で自由度n-1=24の行を見て、tの絶対値3.929に近い有意確率(危険率α)を探します。厳密に計算したい場合は・・・手計算はとても面倒くさいのでExcelなどの表計算アプリを使用すると、セルに「T.DIST.2T(3.929,24)」と入力してリターンするとp=0.000631と表示され、0.5よりも小さな値になりますので、統計的に有意であることがわかります。ちなみにn=5の場合はp=0.154となり、統計的に疑わしくなります。

Mascot Distillerで定量計算を実行した場合は、[メニューバー]→[Analysis]→[Quantitation Reports] に表形式の定量計算結果がリスト表示されます。たとえば [table_proteins] を選択すると別ウインドウに表形式の定量計算結果が表示されますので、そのウインドウをアクティブにした状態で「CTRL+A、CTRL+C、CTRL+V」の順にキー操作を行って表計算アプリに貼り付ければ、上記の要領でタンパク質定量比の期待値pを簡単に一括計算することができます。

Mascot Distillerではペプチド定量比の数nは異なるペプチドの数を使っています。すなわち、異なる電荷状態のペプチドが複数存在する場合でもひとつのペプチドとしてカウントしていますので、マッチしたペプチドの数をnにすればp値を改善するのに役立つかもしれません。上記の定量計算結果リストから [table_peptides] を選択すると楽に処理することができます。

Mascotの定量計算に関する統計処理の詳細に関しては ヘルプページ をご覧ください。

Mascot tip

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